激光共聚焦的工作原理是在传统荧光显微镜成像的基础上，利用激光作为光源，增加了激光扫描装置和共轭聚焦装置。 即检测针孔和光源针孔始终坚持聚焦于同一点，使聚焦平面设计以外被激发的荧光技术不能直接进入系统检测针孔。采用点光源进行照射组织标本，在焦平面上没有形成自己一个重要轮廓结构分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜系统收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光技术直接产品送到探测器，光源和探测器前方都各有不同一个基于针孔，分别研究称为智能照明针孔和探测针孔。两者的几何模型尺寸要求一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过建立一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。以激光逐点扫描分析样品，探测针孔后的光电产业倍增管也逐点计算获得对应光点的共聚焦目标图像，转为发展数字控制信号数据传输至计算机，最终在屏幕上聚合成具有清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦信息系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描技术可以有效实现一个光学断层扫描，形成待观察研究样品聚焦光斑处二维的光学切片。每一幅焦平面进行图像分析实际上是标本的光学横切面，这个过程中光学横切面总是有自己一定厚度的，又称为光学薄片。来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围管理之内，而来自焦平面位置上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能满足成像。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描方式相结合，通过不断累加连续发展层次的二维图像，经过我们专门的计算机应用软件设计处理，可以直接获得不同样品的三维目标图像，计算机控制的数字图像采集和处理系统。
